关键词:
溃疡性结肠炎
痰湿
瘦素
Th17/Treg细胞平衡
JAK2/STAT3信号通路
摘要:
目的:本研究拟通过对比脾虚湿蕴证溃疡性结肠炎患者、非脾虚湿蕴证溃疡性结肠炎患者以及痰湿质健康人群与非痰湿质健康人群体脂、BMI、血清瘦素、IL-17、IL-10水平的差异,探讨瘦素与痰湿以及Th17/Treg平衡之间的相关性,进而阐释痰湿因素的现代微观物质内涵;通过体外实验明确瘦素对Th17细胞以及Treg细胞分化的影响,进一步证明瘦素对Th17/Treg细胞平衡的调控作用;通过体内实验,引入瘦素基因缺陷(ob/ob)小鼠以及同源背景C57BL/6J小鼠,给予瘦素基因缺陷小鼠外源性瘦素补充,以验证瘦素在葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎小鼠中的重要作用,以及对痰湿情况的影响,并探讨瘦素是否通过介导JAK2/STAT3信号通路调控Th17/Treg细胞平衡而实现致病作用,进而明确瘦素调控JAK2/STAT3影响Th17/Treg细胞分化平衡为DSS诱导的结肠炎小鼠发病的关键机制之一。
材料与方法:
1.溃疡性结肠炎患者外周血瘦素水平与痰湿及Th17/Treg平衡相关性的临床研究:收集2021年10月-2022年10月期间于中国医科大学附属第一医院中医科门诊及病房明确诊断为溃疡性结肠炎的患者40例,同时按照年龄(±3)以及性别匹配相应的健康对照者40例。根据中医辨证以体质分类,将溃疡性结肠炎分为脾虚湿蕴证与非脾虚湿蕴证,健康人群分为痰湿质与非痰湿质,每组各20例;采集各组受试者BMI、体脂率、血脂以及血清瘦素、IL-17、IL-10指标。数据采用SPSS25.0软件进行统计学分析,其中多组间数据(BMI、体脂率、leptin、IL-17、IL-10、TC、TG、LDL-C、HDL-C)比较时,正态性数据采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行分析处理,并进一步两两比较,采用Leven法进行方差齐性检验,方差齐采用LSD法,方差不齐则采用Dunnett’T3法,非正态性数据采用Kruskal Wallis方法检验,连续性数据相关性检验采用Pearson相关性分析,计数资料组间差异性采用卡方检验,采用Graphpad Prism 8.4.2软件绘制相应柱状图,以探讨瘦素与痰湿以及IL-17、IL-10水平之间的相关性,阐释痰湿因素的可能现代微观物质内涵。
2.瘦素对初始CD4+T细胞向Th17/Treg细胞分化平衡的影响:采用免疫磁珠法分选C57BL/6J小鼠脾脏初始CD4+T细胞,在体外分别给予Th17细胞以及Treg细胞分化培养条件,在此基础上分别给予250ng/ml瘦素以及250ng/ml瘦素+250n M瘦素受体拮抗剂刺激,其中观察瘦素对Th17分化影响的分组为:空白组、Th17分化对照组、瘦素刺激组、瘦素受体拮抗剂组,而观察瘦素对Treg分化影响的分组为:空白组、Treg分化对照组、瘦素刺激组、瘦素受体拮抗剂组,以上各组在体外于CO2培养箱培养72小时后,采用流式细胞术分别检测各组Th17细胞以及Treg细胞比例情况。所有数据采用SPSS25.0软件进行统计学分析,四组间数据进行比较时,对数据进行正态性检验,若符合正态分布,采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行分析处理,并进一步两两比较,采用Leven法进行方差齐性检验,方差齐采用LSD法,方差不齐则采用Dunnett’T3法;若数据不符合正态分布,则采用Kruskal Wallis检验方法,流式数据图采用Flow Jo v10.8.1CL软件分析绘制,并使用Graphpad Prism 8.4.2软件绘制相应柱状图。以探讨瘦素对Th17细胞以及Treg细胞分化的影响,进而明确瘦素对Th17/Treg细胞平衡的调控作用。
3.瘦素通过JAK2/STAT3信号通路调控Th17/Treg细胞平衡在DSS小鼠发病中的作用以及与“痰湿”因素的相关性研究:将12只C57BL/6J小鼠随机分为c57空白组、模型组(c57+dss)两组,18只ob/ob小鼠随机分为ob空白组、模型组(ob+dss)、瘦素模型(ob+lep+dss)组三组,每组各6只。实验共分为2个阶段,第1阶段为外源性瘦素补充阶段,第2阶段为DSS造模阶段,于实验开始第1天,按照分组给予ob+lep+dss组小鼠外源性瘦素补充,2ug/g腹腔注射,隔日1次,其余小鼠同等浓度生理盐水腹腔注射;在实验第8天,即给予瘦素补充4次后,按照分组分别给予ob+dss组、ob+lep+dss组以及c57+dss组3.5%DSS溶液,自由饮用连续7天,另c57空白以及ob空白组仍正常饮水,在此期间,ob+lep+dss组小鼠仍给予瘦素2ug/g,隔日1次腹腔注射,直至实验结束。在实验期间记录各组小鼠体重、排便、便血等一般以及痰湿情况,取材后检测各组小鼠结肠长度、结肠病理(HE染色)、免疫器官指数、炎症